16.52
Pandu DinGin
BAB I
PENDAHULUAN
1.
Latar Belakang
HIV/AIDS termasuk jajaran penyakit
yang mempunyai tingkat penularan yang sangat tinggi. Hal ini terjadi karena
seringkali seseorang tidak menyadari bahwa dirinya telah terinfeksi HIV,
sehingga menjadi sumber penularan bagi orang lain. Sampai
saat ini diperkirakan terdapat sekitar 28 juta orang lebih yang terinfeksi
HIV di seluruh dunia. Untuk Indonesia sendiri diperkirakan orang yang
terinfeksi HIV mencapai 100.000 sampai 200.000 orang yang dari tahun ke tahun
akan terus bertambah.
Seseorang terkena HIV biasanya
diketahui jika telah terjadi Sindrom Defisiensi Imun Dapatan (AIDS) yang
ditandai antara lain penurunan berat badan, diare berkepanjangan, Sarkoma
Kaposi, dan beberapa gejala lainnya. Berkembangnya teknologi pemeriksaan saat
ini mengijinkan kita untuk mendeteksi HIV lebih dini.
Pemeriksaan Laboratorium yang paling umum dilakukan sebagai
skrining pertama kali dalam melakukan pemeriksaan Anti HIV (merupakan
pemeriksaan anti body) yaitu dengan metode ELISA.
Enzim-Linked
immune sorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa indonesianya disebut sebagai uji
penentuan kadar immunosorben taut-enzim, merupakan teknik pengujian serologi
yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibody dan antigen. Pada
awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi
keberadaan antigen maupun antibody dalam suatu sampel seperti dalam
pendeteksian antibody IgM, IgG, dan IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh
manusia khususnya, misalya pada saat terkena virus HIV). Namun seiring dengan
perkembangan ilmu pengetahuan,teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bidang
patologi tumbuhan, kedokteran, dll.
2.
Rumusan Masalah
2.
1. Bagaimana sejarah penemuan teknik ELISA?
2.
2. Bagaimana prinsip dasar teknik ELISA?
2.
3. Apa saja alat dan bahan yang dibutuhkan dalam teknik ELISA?
2.
4. Apa saja kelebihan dan kelemahan teknik ELISA?
2.
5. Apa saja macam-macam teknik ELISA?
2.
6. Bagaimana langakah kerja teknik ELISA?
BAB II
ISI
1.
Sejarah
Penemuan
Teknik
ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva
Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis
interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi
tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai
pelopor/ reporter/ signal.
Dalam
perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk
mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi
atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji
kuantitatif untuk mengukur kada antibodi atau antigen yang diuji dengan
menggunakan alat bantu erupa spektrofotometer atau dengan cara menetukan jumlah
penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva
standard an kadar antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat ditentukan.
2.
Prinsip
Dasar Teknik ELISA
Prinsip
dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :
Pertama
antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang
berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu
penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan
penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang
bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan
pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik
yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel =>
bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila
sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas
permukaan tersebut,
sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang
bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat
yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut
dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen
spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pda ELISA
flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran
flourescense.
3.
Kelebihan
dn Kelemahan Teknik ELISA
Teknik
ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
·
Teknik
pengerjaan relatif sederhana
·
Relatif
ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
·
Hasil
memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
·
Dapat
digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut
sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen
yang bersifat sangat spesifik)
·
Dapat
digunakan dalam banyak macam pengujian.
Sedangkan
kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
·
Jenis
antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis
antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)
·
Harga
antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
·
Pada
beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol
negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari
larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat
berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.
·
Reaksi
antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan
harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi
dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).
4.
Alat
dan Bahan Yang Digunakan
Alat paling utama yang digunakan
dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini berupa suatu papan plastik
dengan cekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke
samping). Microtiter ini terbuat dari bahan plistirena. Cekungan dari
microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm. Selain itu, alat
dan bahan lain yang umum digunakan dalam teknik ELISA antara lain :
·
Antigen
yang dimurnikan (jika sampel yang akan dideteksi atau dikuantifikasikan berupa
antibodi).
·
Larutan
standard (kontrol positif dan negatif).
·
Sampel
yang ingin dites.
·
Cairan
pencuci (buffer).
·
Antibodi
atau antigen yang tertaut dengan enzim signal.
·
Substrat
yang bersifat spesifik terhadap enzim signal.
·
ELISA
reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.
5. Macam-macam Teknik ELISA
Secara umum, teknik ELISA
dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang menggunakan
konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA
nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik
ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim
yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali
disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah
berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik. Perkembangan ini didasari pada
tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut sehingga dapat
diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA
yang relatif sering digunakan, antara lain :
5.
1. ELISA Direct
Teknik
ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct
menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan
antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada
ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen
yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian
dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang
antigen yang tidak menempel pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang
telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter
sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan
dengan membilas microtiter untuk membuang antibody tertaut enzim signl yang
tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter
tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga
enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat
dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut
selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent,
atau fluorescent end-point.
ELISA
direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
·
Immunoreaktifitas
antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.
·
Penautan
enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
·
Tidak
memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada
percobaan yang berbeda.
·
Amplifikasi
signal hanya sedikit.
·
Larutan
yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan
untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA
direct antara lain :
·
Metodologi
yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
·
Kemungkinan
terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibody lain
(antibody sekunder) dapat diminimalisasi.
5. 2. ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada
dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam
teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan
antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta
antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan
antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada ELISA indirect, pertama
mocrotiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga
antigen spesifik tersebut dapal menempel pada bagian dinding lubang microtiter.
Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada
dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubnag microtiter, sehingga terjadi
terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan. Selanjutnya
microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik. Lalu ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan
yang berisi antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada
lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibody yang diinginkan
dengan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk
membuang antibody sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan
antibody spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yag tertaut dengan
antibody sekunder speifik yang telah berinteraksi dengan antibody yang
diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat
dideteksi.
ELISA indirect memiliki beberapa
kelemahan, antara lain :
·
Membutuhkan
waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA indirect
membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen
spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder
tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali
waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan
dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA
indirect antara lain :
·
Terdapat
berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.
·
Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak
terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibody sekunder karena penautan
dilakuka pada wadah berbeda.
·
Tingkat
sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa
epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
5.
3. ELISA Sandwich
Teknik
ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen
yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA
sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan
antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang
diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik
dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada
antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau
antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA
sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap,
sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap,
sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam
pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi
keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan
dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki
tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan
dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody.
Pada
ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung
antibody penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat menempel pada
bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang
antibody penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian
larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam
lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antibody penangkap
dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk
membuang antigen yang tidak bereaksi dengan antigen penangkap. Lalu, kedalam
lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody detector sehingga
pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang
diinginkan dengan antibody detector. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk
membuang antibody detector yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik.
Kemudian pada tahap akhir ELISA
indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu
enzim yang tertaut pada antibody detector yang telh berinteraksi dengan antigen
yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat
dideteksi.
Dalam
ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas
dari hasil pengujian, antara lain :
·
Banyak
molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding
microtiter.
·
Avinitas
dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya,
teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu,
yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada
pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang
diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody
penangkap dan antibody detector. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga
memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi
antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody
yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda
(epitopnya harus berbeda).
5.
4. ELISA Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)
Pada
perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk mendeteksi
antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal
sebagai teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA
sandwich, hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap
dan antigen detector (antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila
antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan enzim signal).
Contoh
dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin
yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin
menjadi antibody streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat
empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang
teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim
yang menjadi semakin banyak.
5. 5. ELISA Kompetitif
Teknik
ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.Prinsip
dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam
lubang mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk
mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.
Pada
pendeteksian antigen, pertama mikrotiter
diisi antibody spesifik yang dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan
maupun antigen spesifik bertaut enzim signal, sehingga antibody
spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubangmikrotiter.
Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim
signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat
berinteraksi dengan antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas
mikrotiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen
yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Lalu kedalam lubang-lubang
mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian
ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan,
yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibody
spesifik.
Sedangkan
pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik
tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada
bagian dinding-dinding mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang
antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding-dinding mikrotiter. Lalu
larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan enzim
signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan
ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody
spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas
mikrotiter untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody
yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, kedalam lubang-lubang
mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan
antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian
ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi
dengan antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen
spesifik.
Kelebihan
dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap
larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi
hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat
spesitifitas dari antibody dan antigen.
5. 6. ELISA Multiplex
Teknik
ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara
simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.
6. Contoh Langkah Kerja Teknik
ELISA
Berikut
ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
Pendeteksian antibody dengan
ELISA indirect:
1.
Melapisi
mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan
berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2.
Membilas
antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3.
Melapisi
sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan
protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4.
Membilas
protein yang tidak melekat.
5.
Menambahkan
sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody spesifik
untuk berikatan dengan antigen.
6.
Membilas
antibody yang tidak terikat.
7.
Menambahkan
anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik (sebagai
contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc
pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.
8.
Membilas
kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9.
Menambahkan
substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan
dikonversi menjadi produk.
10.
Inkubasi
sampai muncul warna, dan
11.
Ukur
dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar
kadar antibody spesifik dalam sampel.
Pendeteksian antigen dengan ELISA
sandwich:
1.
Melapisi
mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan membiarkan
larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2.
Membilas
antibodi yang tidak terikat dengan buffer
3.
Melapisi
sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan
protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4.
Membilas
protein yang tidak melekat.
5.
Menambahkan
sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk berikatan
dengan antigen spesifik dari sampel.
6.
Membilas
antigen yang tidak terikat.
7.
Menambahkan
antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope
yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8.
Membilas
antibody-enzim yang tidak terikat.
9.
Menambahkan
substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan
dikonversi menjadi produk.
10.
Inkubasi
sampai muncul warna.
11.
Ukur
dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin
besar kadarantigen spesifi dalam sampel.
7. Aplikasi Teknik ELISA
Berikut ini adalah
beberapa ontoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:
a.
Pemeriksaan
donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:
·
HIV-1
dan HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)
·
Hepatitis
C (presence of antibodies)
·
Hepatitis
B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)
·
HTLV-1
dan -2 (keberadaan entibodi)
b.
Pengukuran
level hormone
·
hCG
(sebagai tes kehamilan)
·
LH
( menentukan waktu ovulasi)
·
TSH,
T3dan T4 (untuk fungsi thyroid)
c.
Pendeteksian
Infeksi
·
Agen
penularan secara seksual, HIV, Syphilis dan Chlamydia
·
Hepatitis
B dan C
·
Toxoplasma
Gondii
d.
Pendeteksian
bahan allergen pada makanan dan debu rumah.
e.
Pendeteksian
keberadaan zat obat-obatab terlarabg, seperti
·
Cocain
·
Opium
·
-9-tetrahydrocannabiol,
campuran aktif pada marijuana.
8.
Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG
Pada
hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluran Tuba fallopi, sel telur akan bergerak
menuju Rahim dan melekat pada dinding Rahim tersebut. Sejak saat itulah
plasenta akan mengalami perkembangan dan hCG mulai diproduksi. Human Chorionic
gonadotropin (hCG) pada dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi
oleh sel normal trofoblat pada plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan
dalam darah dan air seni.
hCG
terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen dengan berat
molekul total 39 kD. Subunit rantai
identic dengan subunit rantai
dari hLH (human Luteinizing Hormone), hFSH
(human Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH (human Thyreoidea Stimulating
Hormone). Subunit
bertanggung
jawab pada efek hormonal molekul hCG. Pengukuran hCG yang sempurna dan
keberadaan subunit
memberi hasil yang sama pada darah dan urin,
tapi tidak pada subunit
.
Produksi hormone hCG akan bertambah banyak selama trimester pertama, dimana
level hCG yang sempurna mempunyai rentang dari 20000 mIU/ml sampai 50000 mIU/ml
(1 ng = 15 mIU).
Keberadaan
hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan haid,
yaitu kira-kira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding Rahim. Kadar
hormone tersebut akan terus-menerus bertambah hingga minggu ke 14-16 kehamilan,
terhitung sejak hari terakhir menstruasi. Sebagian besar ibu hamil akan
mengalami penambahan kadar hormone hCG sebanyak dua kali lipat setiap 3 hari. Peningkatan kadar hormone
ini biasanya ditandai dengan mual dan pusing yang sering dialami oleh para ibu
hamil. Selanjutnya kadar hCG akan menurun terus secara perlahan, dan hamper
mencapai kadar normal beberapa saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan
pada saat wanita mengalami keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari
setalah berhubungan.Sampel yang sigunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya
dianjurkan menggunkan air seni yang keluar pertama kali setelah bangun pagi,
karena pada saat tersebut konsentrasi hormone hCG relatif tinggi. Sebenarnya
uji darah pada tes kehamilan yang dilakukan di laboratorium juga memiliki
prinsip kerja yang relatif sama, yait mendekati kadar hCG. Namun, tes darah
mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk mendeteksi usia janin bertumbuh di
dalam Rahim seorang ibu.
|
Perkiraan Kadar hCG
dalam Darah Kehamilan Trimester kedua
|
||
|
Perempuan yang tidak
hamil dan laki-laki
|
Kurang dari 5 IU/L
|
|
|
(international units per liter)
|
||
|
IIbu hamil:
|
24-28 hari setelah haid terakhir
|
5-100 IU/L
|
|
4-5 minggu (1 bulan) setelah haid terakhir
|
50-500 IU/L
|
|
|
5-6 minggu setelah haid terakhir
|
100-10.000 IU/L
|
|
|
14-16 minggu (4 bulan) setelah haid terakhir
|
12.000-270.000 IU/L
|
|
|
kehamilan trimester ketiga
|
1.000-50.000 IU/L
|
|
|
Perempuan pasca menopause
|
Kurang dari 10 IU/L
|
|
Keuntungan
test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormone hCG antara lain:
·
Analisa
yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya memadai.
·
Efisien
dan fleksibel: sampel yang berbeda dapat dianalisa secara stimulant dengan
jumlah cekungan uji yang fleksibel.
·
Spesifik:
sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik berikatan
dengan
-hCG.
·
Prosedur
yang sederhana.
Dalam
pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan sebagaitest
kehamilan untuk mengetahui keberadaan janin dalam Rahim,juga dapat digunakan
untuk berbagai uji kehamilan lainnya, antara lain:
·
Prediksi
kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.
·
Diagnosis
kehamilan yang abnormal.
·
Penentuan
fase kehamilan/ masa kehamilan.
·
Diagnosis
diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau pria.
·
Invertigasi
lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.
Alat
tes hCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di pasaran,
yaitu:
·
Berupa
alat yang digunakan dengan cara memaparkannya pada aliran urin saat pertama
berkemih di pagi hari selama beberapa saat. Jenis alat ini sangat umum
digunakan, karena dijual bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. Berikutini
adalah cara kerjanya:
1.
Pada
saat alat tes mulai bekerja, akan muncul garis pada jedela berbentuk lingkaran
(Jendela control).Dimana garis tersebut merupakan garis konttrol yang
menunjukkan bahwa tes bekerja secara benar.
2.
Jendela
berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis muncul pada jendela
berbentuk persegi (jendela hasil) maka alat tes telah mendeteksi adanya hormone
hCG dan mununjukkan adanya kehamilan.
v
Hasil
negatif: Munculnya satu garis pada jendela konttrol (berbentuk lingkaran)
menandakan bahwa anda tidak hamil dan tes telah dilakukan dengan benar.
v
Hasil
positif: Muncul 2 garis pada jendela control (berbentuk lingkaran) dan jendela
hasil (berbentuk persegi) menandakan anda hamil
v
Hasil
Tidak Valid: Apabila garis pada jendela control tidak muncul berarti tes tidak
dilakukan dengan benar.
·
Berupa
alat digunakan dengan cara membubuhi beberapa tetes serum pada mikrotiter.
Berikut ini adalah cara kerjanya:
1.
Mengandalkan
antibody
-hCG
yang terimbolisasi pada media padat yang berikatan dengan
-hCG
yang bebas dari sampel (urin)
2.
Antibodi
kelinci anti-
-hCG
berkonjungsi dengan horseladish peroxidase (HRP) sebagai larutan konjugasi
antibody-enzim.
3.
Sampel
tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody, menghasilkan
-hCG
antara fase padat denga antibody-enzim.
4.
Setelah
inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
Kemudian substrat HRP, TMB, ditambahkan untuk menghasilkan warna biru.
5.
Perkembangan
warna dihentikan dengan penambahan stop solution yang akan mengubah warna
kuning.
6.
Konsentrasi
-hCG
secara langsung proporsional terhadap intensitas warna yang dihasilkan dan
diukur absorbansinya dengan spektrofotometer.
BAB III
PENUTUP
1.
Kesimpulan
ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay), tes ini
mendeteksi antibodi yang dibuat tubuh terhadap virus HIV. Antibodi tersebut
biasanya diproduksi mulai minggu ke 2, atau bahkan setelah minggu ke 12
setelah terpapar virus HIV. Kerena alasan inilah maka para ahli menganjurkan
pemeriksaan ELISA dilakukan setelah minggu ke 12 sesudah melakukan aktivitas
seksual berisiko tinggi atau tertusuk jarum suntik yang terkontaminasi. Tes
ELISA dapat dilakukan dengan sampel darah vena, air liur, atau air kencing.
Hasil positif pada ELISA belum memastikan bahwa orang yang
diperiksa telah terinfeksi HIV. Masih diperlukan pemeriksaan lain, yaitu
Western Blot atau IFA, untuk mengkonfirmasi hasil pemeriksaan ELISA ini. Jadi
walaupun ELISA menunjukkan hasil positif, masih ada dua kemungkinan, orang
tersebut sebenarnya tidak terinfeksi HIV atau betul-betul telah terinfeksi HIV.
DAFTAR PUSTAKA
·
http://nusaindah.tripod.com/hiv.html
diunduh pada 23 Januari 2012 pukul 13.10 WIB
·
http://my.opera.com/marunting/blog/show.dml/14205592
diunduh pada 24 Januari 2012 pukul 15.30 WIB
·
http://www.catatandokter.com/2008/06/jenis-jenis-pemeriksaan-hivaids.html diunduh pada 23 Januari 2012 pukul 12.30
WIB
·
http://www.scribd.com/doc/39010855/ELISA
diunduh pada 23
Januari 2012 pukul 14.00 WIB
·
http://www.scribd.com/doc/7963861/45/Tes-ELISA
diunduh pada 25 Januari 2012 pukul 16.30 WIB
Elisa test kits Anatomi AIDS Virus
Pengambilan
Sampel Dara untuk tes ELISA
0 komentar:
Posting Komentar